一、细胞培养条件

细胞名称：RFL-6大鼠成纤维细胞

生长特性：贴壁生长

冻存条件：无血清冻存液（货号：C7001）

培养体系：DMEM + 10% FBS + 1% 双抗

传代方法：建议第一次以1:2的比例进行传代

备注：用无菌离心管收集培养基，留作过渡对比培养。如果对比培养效果不理想，建议直接购买环亚集团的完全培养基。

二、细胞收到后的处理

收到细胞后，待细胞培养至良好状态后，灌满完全培养液并封好瓶口，这是运输细胞的最佳方式。首先，用75%酒精喷洒整个细胞瓶以进行消毒，然后将其放置于超净台中进行严格的无菌操作。将细胞瓶放入37℃、5% CO2的培养箱中静置3-4小时，以便稳定细胞状态，然后进行后续处理。在显微镜下观察细胞生长情况，并拍照记录不同倍数（建议40x, 100x, 200x各一张）。前三天的照片是后续售后工作的关键依据，未提供照片的情况下默认收到状态良好。

注意：将培养瓶放入培养箱时，盖子应稍微松动。传代后，建议一瓶使用原瓶的完全培养基，另一瓶使用自配的完全培养基，以便进行对比培养。

三、细胞培养步骤

a. 细胞传代

若细胞汇合度未超过80%，可将瓶装的完全培养液收集至离心管中，留下5ml完全培养基并放入37℃、5% CO2孵箱培养；若细胞密度超过80%，则可进行传代。具体步骤如下：

弃去培养上清，用不含钙、镁离子的PBS润洗细胞1-2次。
加入0.25%胰蛋白酶消化液约1-2ml，放入37℃培养箱消化1-2分钟后观察，如细胞大多变圆并脱落，迅速加入5ml完全培养基终止消化。
轻轻吹打使细胞完全脱落后吸出，将悬液转移至15ml离心管中，以1000RPM离心5分钟，弃去上清液，加入1-2ml完全培养基重悬。
按1:2比例进行分瓶传代（两个T25瓶），补充新的完全培养基至每瓶5-8ml，放入37℃、5% CO2培养箱中培养。

b. 细胞冻存

当细胞生长至覆盖培养瓶80%面积时，弃去培养液，用PBS清洗细胞一次。
加入0.25%胰蛋白酶消化液约1ml，观察细胞回缩变圆后加入5ml完全培养液终止消化，轻轻吹打使细胞脱落，转移至15ml离心管中，并进行1000RPM离心5分钟。
弃去上清，沉淀细胞并加入1ml无血清冻存液（货号：C7001），混匀后加入冻存管中。
将冻存细胞直接放入-80℃冰箱，如需转入液氮罐中，则需在-80℃冰箱存放24小时以上后再转入液氮罐。

c. 细胞复苏

从液氮中取出冻存管（注意佩戴防护设备），迅速置于37℃水浴中解冻，直至冻存管中无结晶，并用75%酒精擦拭管外壁。
将冻存管中的细胞转移至含5ml完全培养基的15ml离心管中，以1000RPM离心5分钟。
弃去上清，沉淀后用5ml完全培养基重悬，接种至T25培养瓶，并放入37℃、5% CO2培养箱中继续培养。
第二天，换用新鲜完全培养基继续培养。

四、注意事项

一些细胞在运输过程中可能会出现脱落的情况，这是正常现象。如果脱落较多，可以将培养瓶的所有培养液收集至离心管，进行1000RPM离心5分钟，收集上清进行过渡培养。在处理时要加入胰酶和完全培养基，轻轻吹打后进行消化，再次离心，弃去上清后重悬细胞，按1:2比例进行分瓶传代，补充新培养基至5-8ml，最终放入37℃、5% CO2培养箱中培养。

五、售后条款

1）细胞出现问题，可重发的情况

运输过程中出现问题，如细胞丢失、瓶身破损、培养液严重漏液等，允许重发。
细胞污染问题，需在收到产品48小时内提供真实实验结果，核实后重发。
常温发货的细胞在静置24小时后，如干冰冻存发货的细胞在复苏后24小时多数细胞未存活（需提供真实清晰的细胞状态照片），允许重发。
如干冰冻存发货的细胞复苏后24小时或常温发货的细胞静置4小时未开封出现污染，允许重发。
若细胞活性存在问题，请在收到产品7天内提供真实实验结果，使用台盼蓝染色法鉴定细胞活力，并核实后重发。
收到细胞当天及第2、3天需拍照，若3天内未告知，则视为产品合格。若4-7天内出现问题，需提供收到细胞前3天的照片以及操作细节与技术人员沟通，由技术人员判定出问题责任，予以重发。

2）细胞出现问题，不予以重发的情况

客户造成细胞污染，不予重发。
因客户不正确操作导致细胞状态不良，不予重发。
因使用非本库推荐培养体系导致细胞状态不良，不予重发。
若细胞状态不良且未提供细胞培养前3天照片，不予重发。
进行其他处理后细胞状态不良，不予重发。
如在收到细胞2天内未提出问题，不予重发。
其他情况将视具体情况而定。

以上是环亚集团关于RFL-6大鼠成纤维细胞的详细培养说明及注意事项，衷心希望您在使用我们的细胞时取得成功的实验结果。